Estructures Genètiques i filogeogràfics del fong simbiòtic

Publicado en Appl Environ microbiol

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1287743/ 

ABSTRACTE

La qualitat i el preu de mercat de la tòfona varien amb l'espècie i, tradicionalment, el lloc d'origen. L'espècie de prima Tuber magnatum produeix tòfones blanques i té una distribució irregular limitada a Itàlia i algunes zones dels Balcans. Es va utilitzar microsatèl polimòrfics per avaluar 316 mostres agrupades en 26 poblacions mostrejades en tot el rang geogràfic de l'espècie per determinar si les poblacions naturals de T. magnatum es diferencien genèticament. Es va trobar que la més meridional i les poblacions més al nord-oest es van diferenciar significativament de la resta de les poblacions. El simple repetició de la seqüència de dades també podria ser utilitzat per fer inferències sobre el postglacial T. magnatum patró d'expansió. Aquest estudi és el primer a identificar una estructura genètica i filogeografia en T. magnatum. La presència d'una estructura genètica pot ser d'interès pràctic en la localització de les poblacions de tòfona en funció del seu origen geogràfic de les estratègies de màrqueting. L'evidència d'una àmplia fecundació creuada en poblacions de camp de T. magnatum també es proporciona per primera vegada.

Tuber spp. són ascomicets hipogeus que creixen en simbiosi ectomicorízics amb alguns arbustos i espècies d'arbres i produeixen ascomas, conegut com tòfones. Algunes tòfones són comestibles i apreciat a tot el món. La seva qualitat i preu del mercat depenen de l'espècie i, tradicionalment, el lloc d'origen. La producció de tòfona natural ha disminuït dràsticament en l'últim segle ( 12 ). Aquest descens i el mercat de la tòfona florent han fomentat programes a gran escala per al cultiu d'aquests fongs a través de la plantació d'arbres micorizades en viver produït. Aquests programes han estat àmpliament desenvolupats per algunes espècies, per exemple, Tuber melanosporum Vittad. i Tuber uncinatum Chatin, i la majoria de la demanda comercial d'aquestes tòfones es conforma per aquestes plantacions artificials en lloc de col · leccions naturals de camp ( 12 ). Producció de tòfones Com la introducció deliberada de ceps estrangeres a les poblacions natives ha afectat i la biodiversitat segueix sent desconegut.

La complexitat del cicle de vida de tòfona, les dificultats de creixement d'aquests fongs en ​​condicions controlades, i la manca de marcadors fenotípics fiables per diferenciar espècies morfològicament similars han estat obstacles importants per a la comprensió de la distribució, la propagació, i la fructificació d'aquests fongs hipogeus. Els marcadors moleculars han estat desenvolupats per escriure la majoria de les espècies de tòfona econòmicament importants ( 2 , 10 , 15 , 19 , 23 , 24 , 25 , 33 , 34 ), però els estudis dels determinants ambientals i moleculars per a diferents parts del cicle de vida generalment es manca. La distribució espacial i els requeriments ecològics d'aquests fongs simbiòtics varien segons l'espècie. Algunes espècies estan àmpliament distribuïdes i han pronunciat la variabilitat morfològica i molecular ( 9 , 11 , 22 , 25 , 27 , 32 ), mentre que altres tenen una distribució més restringida i poc polimorfisme intraespecífica, ja sigui en els trets morfològics o genètics ( 3 , 4 , 8 , 9 , 26 ). Tuber magnatum Pic, que produeix ascomas blanc, es cull només a Itàlia i alguns països de la península balcànica.

En l'espècie relacionada T. melanosporum , hi ha poca o cap diferenciació genètica entre les poblacions mostrejades, i l'espècie és considerada com un que s'auto-fertilitza per a la reproducció sexual i que té una ascocarp que consisteix principalment diploide hifes (dicariòtic) ( 3 , 4 , 21 ). Els pocs estudis de l'estructura genètica i la manera de reproducció de T. magnatum trobar variació intraespecífica allozyme molt limitat i l'absència total d'individus heterozigots ( 8 ). Ja sigui T. magnatum és normalment dicariòtic i reprodueix homothallically o per autofecundació o si està sent un ascomycete exogàmia per determinar.

Els nostres objectius en aquest estudi van ser l'ús de marcadors de microsatèl · lits per a determinar (i) si T. magnatum poblacions són genèticament homogeni, (ii) si el fong és dicariòtic, i (iii) el grau d'encreuament en poblacions de camp. Comprendre el cicle de vida i les diferències genètiques entre les poblacions de tòfona és important per a les estratègies de gestió del creixement de la tòfona i de màrqueting comercial.

MATERIALS I MÈTODES

Font d'exemple.

Ascomas de T. magnatum es van prendre mostres dels terrenys de tòfones naturals en les zones més conegudes i productives d'Itàlia i de la península d'Ístria (Croàcia i Eslovènia) amb l'ajuda dels recol · lectors locals. Quan múltiples mostres van ser proporcionades per la mateixa persona, però l'evidència per a la recol · lecció de diferents llocs físicament era deficient, les mostres van ser seleccionades per clons amb seqüències simples repetides (SSR), i els ceps amb genotips multilocus idèntics es van reduir a un sol representant per a l'estadística anàlisi. Així, només 316 de 351 ascocarps mostrejats van ser utilitzats en l'anàlisi estadística. Aquestes tòfones van ser agrupades en 26 poblacions i després aquestes poblacions es van agrupar en 13 grups en funció de criteris geogràfics (taula (Taula 1). 1 ). Ascocarps també es recollirà a partir de motius d'una sola tòfona (Ascoli, Certaldo i Pietralunga) i s'analitza per determinar la quantitat de variació dins d'una població local (vegeu la Taula SA1 en el material complementari).

 

TAULA 1.

Nom i ubicació de les poblacions estudiades i els paràmetres estimats de diversitat

Aïllament i caracterització de l'ADN SSR.

Preparació de la mostra i l'aïllament d'ADN de tot ascocarps ( 24 ) i l'amplificació dels loci de microsatèl ( 35 ) es van dur a terme com es va descriure prèviament. Els loci MA2 i MA5 són genèticament no vinculada, però cada una conté un (AC) n - (TC) n motiu microsatèl compost. La longitud total d'aquests loci compost s'ha determinat amb anterioritat a conseqüència de PCR amb un parell d'encebadors específica de locus dissenyada en les regions d'acompanyament MA2 i MA5 ( 35 ). Per reduir el biaix a causa de homoplàsia mida, l'amplificació selectiva de només un dels dos motius (MA2-1 i MA5-1) dins de cada un dels dos loci compost es va fer amb un nou conjunt d'encebadors, que consisteix en un encebador niat (5 ' -AGAGAGAGAGTGTGTGTG-3 ') dissenyada en la unió entre els dos motius repetits, en combinació amb el-específica de locus que flanquegen encebadors 5'-CGCAGTGCAAAAAGGAAGCATCA-3' i 5'-CGTCTATTCCCCGCGAGATAACAAC-3 'per MA2 i MA5, respectivament. Les condicions de PCR van ser com es va descriure prèviament ( 35 ). Els fragments d'ADN resultants es van resoldre amb un ABI 310 analitzador genètic (Applied Biosystems, Foster City, CA) per estimar la mida d'al · lel per obtenir informació per a les anàlisis estadístiques. Els 15 al · lels més comuns de MA2-1 i MA5-1 i un representant de cada un dels al · lels dels altres loci de microsatèl · lits, MA4, MA7, MA12, MA14, MA19 i ( 35 ), es van seqüenciar. Les reaccions de seqüenciació es van realitzar directament en productes de PCR purificats (Jet kit espín ràpida; Genomed, Bad Oeynhausen, Alemanya) amb un kit de seqüenciació Big Dye terminator (Applied Biosystems). Mides estimats dels al · lels es van utilitzar per determinar el nombre d'unitats repetides.

Anàlisi de les dades.

Es va calcular la mitjana del nombre d'al · lels i la riquesa al · lèlica, sobre tots els loci, per a cada població. Riquesa lèlica, calculat per a cada població, es va ponderar la menor grandària de mostra ( n = 5), utilitzant un mètode de rarefacció ( 29 ).

De dues locus anàlisi de desequilibri de lligament es va realitzar amb GENEPOP, versió 3.2a ( 30 ), dins de cada població i cada grup geogràfic i en totes les poblacions. L'índex d'associació ( Una ) utilitzat per a la prova de multilocus desequilibri de lligament es va calcular com es descriu per Maynard Smith et al. ( 18 ) amb la multilocus programa, versió 1.2 ( 1 ). El mateix programari es va utilitzar per determinar si Un diferia significativament de zero, mitjançant la realització de 1000 l'assignació a l'atzar del conjunt de dades. El procediment d'assignació a l'atzar es va realitzar per primera vegada per regirar · lels entre tots els individus. Per determinar si els resultats de vinculació desequilibri de l'aïllament reproductiu de poblacions geogràficament distants, randomizations per remenar lels entre els individus dins de les poblacions i dins dels grups geogràfics també es van dur a terme ( 17 ).

Per provar els efectes de la reducció de mida de la mostra en els valors de desequilibri de lligament (LD), dos locus i multilocus anàlisi també es van realitzar considerant un conjunt de dades de 275 individus agrupats com una sola població i s'obtenen en excloure les poblacions situades més al sud i més al nord-oest (3, 4 , 25, i 26).

L'extensió de la subdivisió de la població es va avaluar mitjançant el càlcul de Wright ST ( 39 ) i la relacionada ST ( 37 ) els índexs, amb aquest últim tenint en compte explícitament el procés de mutació que pot passar en els loci microsatèl · lits. Aquests dos índexs es van estimar a través de poblacions i entre parells de poblacions, d'acord amb Weir i Cockerham ( 38 ) i Michalakis i Excoffier ( 20 ), mitjançant l'ús de la SPAGEDI programa, versió 1.1 ( 14 ).

Una matriu de distància genètica de pairwise ST valors també es va utilitzar per realitzar una anàlisi jeràrquic de variància molecular (AMOVA) ( 7 ) amb el programa ARLEQUIN (versió 2.0; Genètica i Biometria Laboratory, Universitat de Ginebra, Suïssa [ https://lgb . unige.ch / arlequin / ]).

La possible presència d'estructura geogràfica de la variació genètica en els microsatèl · lits nuclears en tòfones es va avaluar amb quatre proves. En primer lloc, la prova de la presència de l'estructura filogeogràfic comparant ST estimacions de ST valors calculats després de 10000 permutacions aleatòries dels tipus d'al · lels entre els al · lels ( 13 ) van ser calculats fent servir el programa SPAGEDI. Si ST és> ST (permutada), llavors no és l'estructura filogeográfica, és a dir, de mitjana, al · lels filogenèticament similars es troben en la mateixa població amb més freqüència que són al · lels triat a l'atzar.

En segon lloc, la prova d'un patró d'aïllament per distància ( 31 ). Una prova de Mantel amb 1.000 permutacions aleatòries es va realitzar amb la matriu de diferenciació genètica per parells entre poblacions, utilitzant ST / (1 ​​- ST ), i una matriu de la ln (distància geogràfica) amb el programari Genalex (versió 5.1; Nacional d'Austràlia Universitat, Canberra, Austràlia [ https://anu.edu.au/BoZo/GenAlEx/ ]).

En tercer lloc, una anàlisi d'autocorrelació espacial es va realitzar amb SPAGEDI. Aquesta anàlisi utilitza ST i avaluat 18 classes espacials distància amb mides de mostra similars. Els intervals de confiança del 95% es van calcular per a cada classe de distància per 10.000 permutacions aleatòries.

Finalment, un procediment de recuit simulat implementat en l'anàlisi espacial de la variància molecular algorisme (SAMOVA) ( 6 va ser utilitzat) per definir grups de poblacions que estan geogràficament homogènia i màxim diferenciaran entre si. El programa busca en repetides ocasions la composició d'un nombre definit per l'usuari, K , dels grups de població geogràficament contigües que maximitza CT , la proporció de la variància genètica total a causa de les diferències entre els grups de la població. El programa s'ha executat per 10000 iteracions per K [Membres set]{2, ..., 12} de cada un de 250 condicions inicials aleatòries. El procés de recuit simulat es va repetir 250 vegades per assegurar que la configuració final dels K grups no es veu afectada per una configuració inicial donada ( 6 ). Per a cada K , la configuració amb les majors CT valors després dels 250 processos de recuit simulat independents van ser completats es manté com la millor agrupació de poblacions.

Anar a:

RESULTATS

Enllaç desequilibri anàlisi.

Quan es van incloure els 316 tòfones, l'anàlisi de dos locus tenia desequilibri de lligament significatiu entre molts parells de loci (15 de les 21 combinacions de dos locus).

També hi va haver una diferència significativa amb relació d'equilibri ( A = 0,109, P <0,001) en l'anàlisi multilocus. El desequilibri de lligament pot ser conseqüència de la disminució del flux de gens a causa de la separació geogràfica. Per avaluar el potencial de biaix geogràfic en el nostre anàlisi combinada, aquests assajos també es van realitzar amb mostres en grups geogràfiques més petites. Quan es va calcular el LD de dos locus per a cada un dels 13 grups geogràfics, només una de les combinacions de dos locus tenien una LD significativa, i no es va detectar significativa LD de dos locus quan es van considerar els 26 poblacions locals. De la mateixa manera, que 1 no va ser significativa quan les assignacions a l'atzar es van realitzar per regirar · lels entre les mostres dins dels 13 grups geogràfics i dins de les 26 poblacions locals ( P valors de 0,065 i 0,119, respectivament).

Per avaluar l'efecte de la mida de la mostra en els valors de LD, el LD-dos loci i A les proves també es van calcular per a un conjunt de dades de 275 persones, obtinguda mitjançant l'exclusió de les poblacions establertes 3, 4, 25 sencers de les dades, i 26 que SAMOVA demostrat ser diferenciades genèticament (vegeu més endavant) i per tant s'espera que contribueixi en gran mesura a la LD. En aquesta situació, només 5 de 21 combinacions de dos locus resultar en LD significativa ( P = 0,05), i la que A no ser significativa ( Una = 0,036, P = 0,062), el que suggereix que la disminució en els valors de LD quan les poblacions s'analitzen per separat no és causa de la reducció de mida de la mostra.

Patrons dins i entre la variabilitat de la població.

Els set loci SSR tenia de 2 a 18 al · lels per locus. Dins de cada un dels 351 tòfones analitzats, només es va detectar un sol al · lel per locus. A continuació, cada genotip multilocus va ser tractat com un haplotip en el cas que T. magnatum és un fong haploides (veure Discussió). Les 26 poblacions tenien un nombre mitjà d'al · lels de 3,03 ± 0,12, que van des de 1,86 ± 0,34-4,43 ± 0,97, mentre que la riquesa d'al · lels mitjana va ser de 2.67 ± 0.06, que van des de 1,74 ± 0,26-3,30 ± 0,65 (taula (Taula 1 1 ) .

Sobre la base d'AMOVA, la major part de la variabilitat genètica es troba en el nivell dins de la població, que representa al voltant del 84% de la variància molecular total, mentre que el 6% i el 10% de la variació genètica eren atribuïbles a les diferències entre les poblacions dins dels grups geogràfics i entre els 13 grups geogràfics, respectivament (taula (Taula 2). 2 ). En general, es van detectar 263 haplotips dins de les 316 mostres. Alguns haplotips es van trobar en múltiples llocs a la mateixa regió, i alguns van ser trobats en diverses poblacions o grups (vegeu Taula SA1 suplementari).

 

TAULA 2.

AMOVA basat en 316 tòfones utilitzant 07:00 loci SSR

Cada població conté un nombre relativament gran d'haplotips. Dins d'una planta de tòfona individual, la variació genètica es va reduir lleugerament, a causa que algunes tòfones probablement es van originar en el mateix miceli vegetatiu. Per exemple, una de les nou ascocarps collides a Certaldo, només es van trobar tres haplotips. No obstant això, a partir dels 16 i 10 ascocarps d'Ascoli i Pietralunga, es van identificar 10 haplotips i 7, respectivament.

La majoria dels al · lels no eren úniques per a una població, però alguns al · lels podria ser utilitzat per caracteritzar tòfones d'acord amb el seu origen geogràfic causa de les seves freqüències diferencials en alguns grups de poblacions. Per exemple, la freqüència l'al · lel 17 en el locus MA7 va ser alta a les poblacions del sud 23, 24, 25, i 26 (0,2, 0,4, 0,4, i 1,0, respectivament), mentre que els al · lels 14, 24, 34, i 35 de MA4 es troba només en els individus de poblacions 3, 4 i 5 de Piemonte, la zona més nord-occidental de mostreig.

Una diferència marcada i altament significativa entre poblacions va ser suggerit pels ST i ST valors, que eren 0,15 i 0,22, respectivament. Un senyal filogeográfica també es va detectar amb els procediments de permutació en la mostra total [ ST de 0,22 enfront de ST (permutada) de 0,12, P = 0,0005]. La prova d'aïllament per distància va mostrar que la diferenciació entre la població va augmentar significativament amb ln (distància geogràfica) (prova de Mantel, P <0,006), tot i la regressió explica només el 5,4% de la variància total ( 2 = 0,054) (Fig. (Fig. 1A 1A ).

 

La figura. 1.

(A) Correlació entre pairwise distàncies genètiques i geogràfiques. (B) La distància mitjana genètica ( ST ) durant 18 classes a distància espacials. Les línies intermitents indiquen els límits dels intervals de confiança del 95% estimat per permutació.

L'anàlisi d'autocorrelació espacial ens va permetre examinar el grau d'associació en diferents classes de la distància geogràfica. Aquesta anàlisi va confirmar el patró geogràfic de la variació genètica, amb poblacions separades per> 450 quilòmetres sent significativament més separats genèticament que s'esperaria per atzar (fig. (Fig. 1B). 1B ). Els resultats de SAMOVA van confirmar l'existència d'estructura geogràfica en la T. magnatum poblacions. En particular, quan ST s'utilitza, les poblacions del sud 25 i 26 i les poblacions del nord-oest 3 i 4 eren clarament distingible dels altres (Fig. (Fig. 2 2 ).

 

La figura. 2.

Mostreig de les localitats i la distribució geogràfica de la variabilitat genètica. Els números es refereixen a les poblacions enumerades a la taula Taula1. 1 . Els diàmetres dels cercles són proporcionals a les grandàries de mostra. Cercles diferentment ombrejades mostren genèticament diferents ...

Anar a:

DISCUSSIÓ

Encara que una disminució de la producció ha provocat la investigació sobre el cultiu de la tòfona, molts dels aspectes bàsics de la biologia de la tòfona, com la manera de reproducció i la quantitat i distribució de la variació genètica de la població, no estan ben enteses. Les capacitats limitades d'sapròfits miceli de la tòfona i la impossibilitat d'obtenir cultius monospóricos o creuar ceps de miceli en condicions controlades han frenat l'avaluació directa de la manera de reproducció d'aquests organismes.

Utilitzem marcadors codominants (loci microsatèl · lits polimòrfics) i els ceps incloses en la mostra a través de tota l'àrea de distribució coneguda de l'espècie per inferir l'estructura genètica, dinàmica poblacional, i la manera de reproducció de T. magnatum , el més prestigiós de les espècies comestibles del gènere Tuber . Només es va trobar un sol al · lel per locus en cada un dels 351 tòfones analitzats. Aquests resultats són consistents amb els de Bertault et al. ( 3 ) per T. melanosporum . Ells prèviament van interpretar l'absència de heterozigots en el sentit que aquests fongs són funcionalment diploide amb un sistema reproductiu estrictament auto-fertilització. Interpretem aquestes dades per significar que el ascocarps de T. magnatum són teixit matern haploides, que es troba des de fa molts ascomicets. De dues locus i vinculació anàlisi multilocus desequilibri indiquen que tant al T. Magnatum grups geogràfics i de les poblacions, ampli intercanvi genètic passa. El nombre relativament alt de genotips multilocus dins de les poblacions suggereix que aquests fongs no són molt pures. Dins dels mateixos motius de tòfona, les diferències entre els haplotips es van produir normalment en múltiples loci en lloc d'en un sol lloc (vegeu la Taula SA1 suplementari), un patró consistent amb la recombinació en addició a la mutació com una font per a la variació observada en els haplotips.

Els ascocarps tòfona se suposa que són els teixits principalment de la mare i per tant serien haploides. ADN Paternal podria no ser tan fàcilment recuperables ja que estaria present només en les ascospores, i aquestes espores no estan trencades durant el procés d'extracció d'ADN que fem servir. Per tant, el teixit matern haploides serà el component dominant de la tòfona i presumiblement representa els genotips que analitzem en aquest estudi.

Desequilibri de lligament significatiu es va trobar només quan tot el conjunt de dades de tòfona es va avaluar com un tot i podria explicar-se si no va ser significativa subdivisió de la població geogràfica. Els ST i ST estadístiques i la correlació entre la distància genètica i geogràfica són consistents amb la diferenciació genètica de les poblacions, mentre que els resultats de la ST permutació anàlisi són consistents amb l'estructura filogenètica. Si les poblacions individuals s'eliminen de l'anàlisi, a continuació, l'eliminació de la situada més al sud i dues poblacions northwesternmost permet que la resta de les poblacions a ser agrupats junts.

La distribució geogràfica de T. magnatum seguiment de l'expansió postglacial de l'espècie amb la qual aquest fong pot establir una simbiosi mutualista. Refugia per algun T. magnatum espècies hoste (per exemple, Quercus , Corylus , Tilia , i Carpinus ) es troba al centre i sud d'Itàlia i es va estendre cap al nord com el gel va retrocedir ( 5 , 28 ). Un refugi per T. magnatum al centre d'Itàlia, a partir del qual es van originar les poblacions situades més al nord i més al sud, podria explicar els resultats observats.

La variació genètica i la distribució geogràfica dels marcadors SSR podrien permetre la localització i identificació de T. magnatum poblacions. L'origen geogràfic de les tòfones sovint important a les associacions de recol · lectors de tòfona i els governs locals que promouen el desenvolupament econòmic i social de les zones rurals i marginals. L'estructura genètica de les poblacions de T. magnatum també té importants implicacions ecològiques. Plantacions artificials de fongs sovint s'estableixen en zones naturalment productius per contrarestar una forta disminució de les collites de tòfones silvestres. Els problemes potencials relacionats amb la competència microbiana són en gran part inexplorat pel que fa al cultiu de la tòfona, i les conseqüències de la introducció deliberada de ceps natives en una població indígena han estat greus per altres fongs comestibles ( 16 , 36 ). Per tant, la pràctica comercial rendible de les plantacions artificials de fongs pot causar una pèrdua de la biodiversitat fúngica, i els ceps locals amb característiques comercials úniques podria extingir-se. Per tant, quan es preveu el cultiu de tòfona blanc a les zones productives naturalment, han d'usar-ceps de tòfona ecològicament adaptades que són similars als ja presents a la regió. Precaucions similars s'apliquen també a T. melanosporum ( 21 ). Els marcadors de SSR que utilitzem podrien utilitzar per escriure soques de T. magnatum que es va inocular en plàntules produïdes comercialment, així com per avaluar l'impacte de les soques introduïdes podria tenir sobre les poblacions ectomicorízics natives.

La presència de l'estructura genètica de les poblacions de les dues espècies de tòfones més prestigiosos argumenta en contra de la hipòtesi que diferències fenotípiques i organolèptiques entre tòfones de diferent origen es deuen únicament a factors ambientals ( 3 ). Si els loci SSR examinats estan relacionats amb els gens que controlen aquests trets d'importància comercial, llavors els marcadors SSR es podrien utilitzar per seleccionar els ceps amb característiques desitjables per a ús comercial futur. A mesura que les nostres dades suggereixen que les tòfones no són estrictament auto-fertilització, la possibilitat de millorar aquests fongs a través dels protocols convencionals de millora ha de ser avaluat amb més cura i amb més detall. Aquest estudi proporciona la primera evidència que suggereix que les tòfones no són estrictament organismes auto-fertilització i han de donar lloc a una reavaluació significativa del cicle de vida i la biologia de T.  magnatum i altra Tuber spp.